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2022-09-24 04:45:07 By : Ms. Susan Song

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B. angiogenen parakrinen Faktoren, ausgeübt wird, die von diesen Zellen sezerniert werden3,4,5.Bedingtes Medium (CM) hat als therapeutisches Mittel beträchtliche Aufmerksamkeit erregt, da verschiedene parakrine Faktoren, die von kultivierten Zellen sezerniert werden, in CM4,5 vorhanden sind.In CM vorhandene parakrine Faktoren können Zielzellen stimulieren und behandeln;Daher ist die CM-Verabreichung eine potenzielle therapeutische Alternative zur direkten Injektion von Zellen in den Körper.Parakrine Faktoren, die in Stammzell-CM freigesetzt werden, lassen sich nur schwer künstlich reproduzieren4,6.Da CM außerdem leicht zu lagern ist, hat es ein immenses Potenzial als Therapeutikum7.Damit CM bei klinischen Behandlungen wirksam ist, muss die Konzentration der darin enthaltenen spezifischen Wachstumsfaktoren erhöht werden8,9.In einer klinischen Studie, in der CM aus menschlichen Fettstammzellen (hADSCs) zur Behandlung von Hautwunden verwendet wurden, wurde die hautverjüngende Wirkung von CM gezeigt;die hautstraffende Wirkung wurde jedoch nicht verbessert.Die Ergebnisse der Studie deuteten darauf hin, dass eine unzureichende Menge an Zytokinen im CM die Ursache für die schlechten therapeutischen Ergebnisse war10.Obwohl Proteinkonzentratoren (z. B. Zentrifugalfilter) weithin verwendet werden, um die Konzentration von Wachstumsfaktoren in CM zu erhöhen, können sie den Anteil verschiedener Moleküle verändern und möglicherweise nicht spezifisch die Konzentration des für die Behandlung einer bestimmten Krankheit entscheidenden Wachstumsfaktors erhöhen , wie ischämische Erkrankungen11,12.Daher ist das Priming von Zellen zur Erhöhung der Konzentration spezifischer parakriner Faktoren im CM eine vielversprechende Strategie13,14,15.Darüber hinaus können exogene Substanzen verwendet werden, um Zellen zur Sekretion spezifischer parakriner Faktoren anzuregen.Nach der Vorstimulation mesenchymaler Stromazellen mit TGF-β1 und Lithiumchlorid wurde festgestellt, dass CM aus diesen Zellen erhöhte Mengen an inhibitorischen Proteinen und vaskulärem Endothelwachstumsfaktor (VEGF) enthielt und das Haarwachstum in klinischen Studien erfolgreich verbesserte15.In dieser Studie zielten wir darauf ab, die Konzentration von pro-angiogenen parakrinen Faktoren in CM zu erhöhen, die eine wichtige therapeutische Rolle bei ischämischen Erkrankungen spielen16,17, indem sie die Zellfunktion induzieren, ohne die Verwendung von postkondensierten Prozessen oder Xenobiotika.Der mechanistische Prozess der Anreicherung angiogener parakriner Faktoren in CM (mit dem Ziel, ischämische Erkrankungen zu behandeln) ist in Abb. 1 dargestellt. CM wurde von hADSCs gesammelt, die leicht zu isolieren sind und verschiedene parakrine Faktoren sezernieren18,19,20.Darüber hinaus wurden hADSCs als dreidimensionale (3D) Sphäroide entwickelt und einer Low-Level-Lichttherapie (LLLT) unterzogen, um CM zu produzieren, das mit angiogenen parakrinen Faktoren angereichert ist.Links, Mitte: Präparation von CM, angereichert mit angiogenen parakrinen Faktoren, die auf ischämische Erkrankungen abzielen und aus humanen Fettstammzellen (hADSCs) gewonnen wurden.Rechts: Positive Wirkungen, die für die Behandlung von ischämischen Erkrankungen relevant sind, werden aufgelistet.Es wurde berichtet, dass hADSCs, die als 3D-Sphäroide kultiviert wurden, im Vergleich zu Zellen, die in einer zweidimensionalen (2D) Kultur kultiviert wurden, erhöhte Mengen an angiogenen Wachstumsfaktoren absondern21,22.Wenn sie als Sphäroide kultiviert werden, werden die Zellen innerhalb des Sphäroids einer Hypoxie ausgesetzt, was die Sekretion von Wachstumsfaktoren stimuliert23,24,25.Wenn die Sphäroide jedoch eine große Anzahl von Zellen enthalten, unterliegen die Zellen innerhalb des Sphäroids einer Nekrose, was die Lebensfähigkeit der Sphäroide beeinträchtigt26,27.In der vorliegenden Studie wurde LLLT auf hADSC-Sphäroide angewendet, wobei organische Leuchtdioden (OLEDs) mit einer Wellenlänge von 600–700 nm verwendet wurden;diese Wellenlänge wird hauptsächlich zur Behandlung von Modellen ischämischer Erkrankungen mit der konventionellen LLLT-Technik verwendet28,29,30.Bei bestehenden Techniken werden die Zellen in der Zielläsion meistens lichtstimuliert;Daher ist es schwierig, ein Behandlungsprotokoll für LLLT im klinischen Umfeld zu erstellen31,32.Durch die Kombination dieser Methoden haben wir eine große Anzahl von hADSCs mit dem gleichen Volumen an Kulturmedium kultiviert und LLLT angewendet, um die Sekretion von Wachstumsfaktoren zu erhöhen.Wichtig ist, dass in hADSCs, die als 3D-Sphäroide gezüchtet werden, die internen Zellen durch die hypoxische Umgebung stimuliert werden, während die externen Zellen durch LLLT stimuliert werden, was die intrinsische parakrine Faktorsekretionskapazität von hADSCs signifikant erhöht, ohne dass exogene Substanzen eingreifen.Zusammenfassend verbesserte der in dieser Studie verwendete Ansatz die Fähigkeit von hADSCs, angiogene parakrine Faktoren abzusondern, indem dicht besiedelte hADSC-Sphäroide unter serumfreien Bedingungen direkt mit Licht (600–700 nm) bestrahlt wurden.Wir untersuchten die therapeutische Wirkung von CM auf hADSCs und humane Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs), die in vitro kultiviert wurden.Darüber hinaus wurde die therapeutische Fähigkeit von CM in einem Mausmodell der Ischämie der Hinterbeine evaluiert.Unsere Studie liefert starke Beweise für die klinische Anwendung von CM bei der Behandlung von ischämischen Erkrankungen.Wir präsentieren in Abb. 2a einen Überblick über die in dieser Studie verwendeten experimentellen Methoden.Wenn Stammzellen in einer 3D-Sphäroidform kultiviert werden, ist ihre therapeutische Wirksamkeit höher als die von Zellen, die in einer 2D-Kultur gezüchtet werden21,22.Einer der Gründe für dieses Phänomen ist, dass die Zellen eine Hypoxie erfahren, wenn sie in der 3D-Form kultiviert werden23,24,25.Wir bestätigten jedoch, dass die Expression von HIF-1α, die in den hypoxischen Zellen zunimmt, nicht signifikant unterschiedlich war (Abb. 2b).Ein Grund für dieses Ergebnis kann sein, dass die durchschnittliche Genexpression in hADSCs vom gesamten Sphäroid abgeleitet wurde.Im Gegensatz dazu stieg die Expression von VEGF, das durch HIF-1α33 hochreguliert wird, in der 3D-kultivierten Gruppe im Vergleich zu der in der 2D-Gruppe signifikant an;außerdem nahm sie in der SR-Gruppe deutlich zu (Abb. 2b).Anschließend bewerteten wir den Expressionsgrad von HIF-1α und VEGF in den hADSC-Sphäroiden unter Verwendung von Immunhistochemie (IHC)-Färbung (Abb. 2c).HIF-1α und VEGF waren innerhalb der Sphäroide in der S-Gruppe und überall in den Sphäroiden in der SR-Gruppe konzentriert.Dementsprechend analysierten wir die Expression von Von Hippel Lindau (VHL), AKT und VEGF unter Verwendung von Western Blotting.Wie in Abb. 2d gezeigt, war die Expression von VHL in der SR-Gruppe verringert.VHL verringert die Stabilität von HIF-1α, indem es die Hydroxylierung von HIF-1α induziert34,35.Die AKT-Expression war zwischen den beiden Gruppen vergleichbar, aber die VEGF-Expression nahm in der SR-Gruppe zu.Zusätzlich erhöhte sich durch die Behandlung der Sphäroide mit rotem Licht die Expression von VEGF in den hADSCs, aus denen die Sphäroide bestehen (Abb. 2b–d).Auf dieser Grundlage wurde das gesammelte CM mit einem Angiogenese-spezifischen Array (Abb. 2e) und ELISA (Abb. 2f) analysiert, um festzustellen, ob die hADSC-Sphäroide nach einer Rotlichtbehandlung erhöhte Mengen an Angiogenese-bezogener parakriner Faktoren freisetzten.Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression verschiedener Faktoren bei den CM aus der SR-Gruppe höher war als bei den CM aus der S-Gruppe (Abb. 2e).Die Faktoren, die Angiogenese induzieren können, nämlich FGF-1, KGF, IL-1b, HRG1-b1 und PD-ECGF, wurden nur in der SR-Gruppe nachgewiesen, wenn auch in geringen Mengen.Die Spiegel der Pro-Angiogenese-Faktoren, nämlich TF, ET-1, IL-8, Persephin und Pal-1, waren in der SR-Gruppe geringfügig höher als in der S-Gruppe.Insbesondere stiegen die Spiegel wichtiger Pro-Angiogenese-Faktoren, nämlich Ang-1, Artemin, CD105, FGFR2, IGFBP-3, CCL3 und μPA, in der SR-Gruppe um das Doppelte oder mehr an als in der S-Gruppe.Ang-1 kann die Angiogenese in Übereinstimmung mit VEGF36 verstärken.Es ist auch bekannt, dass IGFBP-3 die VEGF-Expression hochreguliert37.Anschließend wurde die Konzentration von VEGF im CM (3 × 104 Zellen/400 μL serumfreies Medium) mittels ELISA quantifiziert;die VEGF-Konzentration in der SR-Gruppe betrug 984,17 pg·mL –1 , was 1,4-fach und 10-fach höher war als das Niveau, das in der S-Gruppe bzw. 2D-Gruppe gefunden wurde ( 2f ).a Schematische Darstellung der dreidimensionalen Kultur von hADSCs und Bestrahlung mit rotem Licht.b Relative Expression von HIF-1α und VEGF in hADSC-Sphäroiden, die mit rotem Licht behandelt wurden (n = 5, *p < 0,05 vs. 2D-Gruppe, #p < 0,05 vs. jede Gruppe).c Repräsentative Bilder der HIF-1α- und VEGF-Färbung in den hADSC-Sphäroiden (grün, HIF-1α oder VEGF; blau, Kerne).HIF-1α (Maßstab, 250 um) und VEGF (Maßstab, 100 um) sind mit weißen Pfeilen gekennzeichnet.d Western-Blot-Analysen wichtiger parakriner Pro-Angiogenese-Moleküle in hADSC-Sphäroiden, die mit rotem Licht behandelt wurden.Quantifizierung des relativen Proteinspiegels (n = 3, *p < 0,05 vs. S-Gruppe).e Expression von Angiogenese-verwandten Proteinen in CM, analysiert unter Verwendung eines humanen Angiogenese-Arrays.f Konzentration von VEGF im CM, abgeleitet von 2D-Kultur, S oder SR, wie unter Verwendung von Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA; n = 5, *p < 0,05 vs. 2D-Gruppe, #p < 0,05 vs. jede Gruppe) bewertet .Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestelltDie optischen Mikroskopbilder der Sphäroide zeigten, dass es keinen Unterschied zwischen der Sphäroidgruppe (S) und der Gruppe der Sphäroide unter Rotlichtbehandlung (SR) gab (Abb. 3a).Darüber hinaus zeigten die Bilder der Fluoreszenzfärbung der lebenden/toten Zellen keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der toten Zellen (rot) zwischen der S- und der SR-Gruppe (Abb. 3b).Darüber hinaus gab es keinen Unterschied in der Expression von CASPASE-3 in hADSCs aus der SR-Gruppe im Vergleich zu denen aus der S-Gruppe (Abb. 3b).Darüber hinaus untersuchten wir, ob es nach Rotlichtbestrahlung signifikante morphologische Veränderungen in den Sphäroiden gab.Um die hADSC-Sphäroidoberfläche genauer zu untersuchen, wurde eine Rasterelektronenmikroskopie (SEM) durchgeführt (Abb. 3c).Die SEM-Bilder zeigten keine merkliche Veränderung in der Morphologie der Sphäroide nach Rotlichtbehandlung.Darüber hinaus wurde kein Unterschied in der inneren Struktur der Sphäroidschnitte (10 μm) nach Hämatoxylin- und Eosin- (H & E) und F-Aktin-Färbung beobachtet (Abb. 3d).Wenn diese Ergebnisse zusammen betrachtet werden, können wir bestätigen, dass die Rotlichtbehandlung von hADSC-Sphäroiden die Sphäroidstruktur nicht verändert oder Zytotoxizität induziert.a Repräsentative Morphologie des hADSCs-Sphäroids nach Rotlichtbehandlung.b Zelllebensfähigkeit der hADSC-Sphäroide nach Rotlichtbehandlung, bewertet mit dem Fluoresceindiacetat-Ethidiumbromid (FDA-EB)-Assay (grüne, lebende Zellen; rote, tote Zellen; Maßstabsbalken, 500 μm) und Expression von CASPASE-3 in hADSC Sphäroide (n = 6, Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt).c Repräsentatives REM-Bild von fabrizierten Sphäroiden.d H&E- und F-Aktin-Färbung im Inneren von Sphäroiden (S und SR).Die 3D-Kultur erhöht die Anzahl der Zellen, die pro Flächeneinheit kultiviert werden können, im Vergleich zur 2D-Kultur.Daher haben wir versucht, die Anzahl der Sphäroide zu erhöhen, die in der gleichen Fläche und im gleichen Volumen des serumfreien Mediums kultiviert wurden.Gleichzeitig wurde rotes Licht verwendet, um die Sphäroide zu behandeln.Da Licht pro Sphäroid gleichermaßen Energie liefert, können wir mit dieser Technik die Bedingungen anwenden, die auf Zellen in der vorherigen SR-Gruppe angewendet wurden.Gemäß früheren ELISA-Ergebnissen betrug die Konzentration von VEGF in der SR-Gruppe 984,17 pg·mL-1.Frühere Studien haben gezeigt, dass die Injektion oder Verabreichung von 2,0–2,5 μg VEGF in die ischämische Region bei Mäusen mit 20 bis 25 g Körpergewicht eine therapeutische Angiogenese bewirkte38,39.Andererseits haben Studien zur Anwendung von CM, die verschiedene angiogene parakrine Faktoren enthalten, zur Behandlung von ischämischen Erkrankungen eine große Bandbreite an VEGF-Konzentrationen gezeigt40,41.Gemäß einer früheren Studie war die Behandlungseffizienz unter CMs, die aus verschiedenen Zellen extrahiert wurden, am besten, wenn die Menge an VEGF, die Mäusen durch das CM zugeführt wurde, etwa 4 ng40 betrug.Wenn daher die in der SR-Gruppe beobachtete VEGF-Konzentration weiter um etwa das Siebenfache erhöht werden könnte, könnte die für die Behandlung ausreichende Menge an VEGF innerhalb von 4 Tagen durch Injektion an die Läsion der Maus abgegeben werden.Zuerst wurden Sphäroide dicht kultiviert (7x) in der gleichen Menge an serumfreiem Medium und mit rotem Licht (Sx7R-Gruppe) stimuliert.Die Veränderungen in der Sphäroidstruktur und Zytotoxizität wurden untersucht.Es gab keine signifikanten Veränderungen in der Morphologie (Abb. 4a – b);Der Durchmesser der Sphäroide nahm jedoch bis zu einem gewissen Grad ab (Abb. 4c).Ein verringerter Durchmesser wurde auch beobachtet, wenn die gleiche Anzahl von Sphäroiden ohne Lichtstimulation kultiviert wurde (Sx7-Gruppe, ergänzende Abb. 1a).Darüber hinaus beobachteten wir keine Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen im Lebend/Tot-Assay (Abb. 4d) und die Expression von BCL-2 und CASPASE-3 (Abb. 4e) in den Sphäroiden der Sx7R-Gruppe.Ein Mangel an Zytotoxizität wurde auch durch die Expression von Apoptose-bezogenen Genen beobachtet, wenn die gleiche Anzahl von Sphäroiden ohne Lichtstimulation kultiviert wurde (ergänzende Abb. 1b).Unter Verwendung der quantitativen Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) bestätigten wir, dass die Lichtstimulation hADSC-Sphäroide induzierte, um die Expression von pro-angiogenen Faktoren in der Sx7R-Gruppe wie in der SR-Gruppe zu verstärken (Abb. 4f).Die Expression von VEGF und FGF2 war in den mit rotem Licht bestrahlten Sphäroiden, den SR- und Sx7R-Gruppen, hochreguliert und hatte eine ähnliche relative Expression in beiden Gruppen im Vergleich zu der in der S-Gruppe.Wenn die Anzahl der Sphäroide ohne Lichteinwirkung konzentriert wurde, stieg die VEGF-Expression nicht an (ergänzende Abb. 1c).Als die Menge an VEGF und FGF2 mit ELISA analysiert wurde, hatte die Sx7R-Gruppe außerdem eine deutlich höhere Konzentration, 6.594,9 pg·mL–1 für VEGF und 946,9 pg·mL–1 für FGF2, verglichen mit der in anderen Gruppen (Abb .4g).a Repräsentative morphologische Merkmale, bewertet durch H&E- und F-Aktin-Färbung von dicht kultivierten hADSC-Sphäroiden, die mit Rotlichtbestrahlung behandelt wurden.b Repräsentative SEM-Bilder, die die Oberflächenmorphologie des Sphäroids zeigen.c Messungen des Sphäroiddurchmessers (n = 7, *p < 0,05 vs. S-Gruppe, ##p < 0,001 vs. jede Gruppe).Die Zelllebensfähigkeit wurde mit dem FDA-EB-Assay (d, Skalenbalken = 500 μm) bewertet und die relative Expression von BCL-2 und CASPASE-3 in hADSCs wurde unter Verwendung der S-Gruppe als Kontrolle analysiert (e, n = 4).f Relative Expression von VEGF und FGF2 in den dicht inkubierten hADSCs-Sphäroiden nach Rotlichtbehandlung unter Verwendung der S-Gruppe als Kontrolle (n = 4, *p < 0,05 gegenüber der S-Gruppe).g Relative Konzentration von VEGF und FGF2 in CM, bewertet mit ELISA (n = 5, *p < 0,05 vs. S-Gruppe, **p < 0,001 vs. S-Gruppe, #p < 0,05 vs. jede Gruppe, ##p < 0,001 vs. jede Gruppe).Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestelltDas therapeutische Potenzial des nach jeder Kulturmethode gesammelten CM wurde in vitro bestätigt.Als in 2D kultivierte hADSCs 24 Stunden lang den verschiedenen CMs ausgesetzt wurden, wurden keine morphologischen Unterschiede beobachtet (Abb. 5a), während die Zelllebensfähigkeit in der Sx7R-Gruppe, gefolgt von der in der SR-Gruppe, im Vergleich zu der in den anderen Gruppen zunahm (Abb. 5b).Die S-Gruppe zeigte jedoch keinen Unterschied in der Lebensfähigkeit der hADSCs im Vergleich zur Gruppe ohne Behandlung (NT).Um die Verbesserung der hADSC-Migrationsfähigkeit nach Behandlung mit verschiedenen CMs zu untersuchen, wurde ein Scratch-Assay durchgeführt (Abb. 5c, d).24 Stunden nach dem Kratzen der hADSCs wurde in der Sx7R-Gruppe eine maximale Wundbedeckung beobachtet.Schließlich untersuchten wir, ob mit konzentrierten Angiogenese-bezogenen parakrinen Faktoren angereichertes CM die angiogene Fähigkeit von Endothelzellen erhöhte (Abb. 5e, f).HUVECs, die 12 h CM ausgesetzt waren, und alle Gruppen, die CM ausgesetzt waren, zeigten eine verbesserte Angiogenese im Vergleich zu der in der NT-Gruppe, und in der Sx7R-Gruppe wurde eine maximale Röhrenbildung beobachtet.a Repräsentative lichtmikroskopische Bilder von hADSCs, nachdem die Zellen 24 h lang mit den verschiedenen CMs behandelt wurden.b Relative zelluläre Lebensfähigkeit von hADSCs, die mit den verschiedenen CMs behandelt wurden, bewertet mit CCK-8 (n = 5, *p < 0,05 vs. Gruppe ohne Behandlung (NT), **p < 0,001 vs. NT-Gruppe, #p < 0,05 vs . jede Gruppe, ##p < 0,001 vs. jede Gruppe).c, d Repräsentatives Bild der Kratzabdeckung in hADSCs, nachdem die Zellen 24 h lang mit den verschiedenen CMs behandelt wurden.Die relative Zellmigrationsfläche im Vergleich zur anfänglichen Kratzfläche ist ebenfalls gezeigt (n = 5, *p < 0,05 vs. NT-Gruppe, **p < 0,001 vs. NT-Gruppe, #p < 0,05 vs. jede Gruppe).e, f Um die Angiogenesefähigkeit verschiedener CMs auf den HUVEC zu bestimmen, wurde der Röhrchenbildungsassay durchgeführt, um HUVEC zu untersuchen, nachdem die Zellen für 12 h mit CM behandelt wurden (n = 5, *p < 0,05 vs. NT-Gruppe, ** p < 0,001 vs. NT-Gruppe, #p < 0,05 vs. jede Gruppe, ##p < 0,001 vs. jede Gruppe).Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestelltUm die in vitro beobachtete therapeutische Wirksamkeit von CM bei ischämischen Erkrankungen zu bestätigen, wurde die Wiederherstellung der ischämischen Hinterbeine unter Verwendung eines ischämischen Maus-Hinterbeinmodells bewertet42,43.Das Versuchsprotokoll folgte den Richtlinien für die ethische Behandlung von Versuchstieren, wie im nachstehenden Abschnitt Methoden beschrieben.Der experimentelle Zeitplan ist in Fig. 6a gezeigt.Jedes CM wurde 4 Tage lang, 0 bis 3 Tage nach der Operation, in den Gracilis-Muskel (150 &mgr;l·Tag – 1) injiziert.Die Mäuse wurden in die folgenden vier Gruppen eingeteilt: PBS (Placebo), CM, gesammelt aus der S-Gruppe (S), CM, gesammelt aus der SR-Gruppe (SR) und CM, gesammelt aus der Sx7R-Gruppe (Sx7R).Achtundzwanzig Tage nach den verschiedenen Behandlungen wurden die Mäuse aus jeder Gruppe in der Reihenfolge Gliedererhaltung, Zehennekrose und Gliedernekrose und Verlust klassifiziert, basierend auf ihren Gliederzuständen ( 6b ).Der höchste Anteil an Mäusen, die sich relativ gut erholten (Gliedmaßenerhaltung und Zehennekrose), betrug 90,01 % in der Sx7R-Gruppe, gefolgt von 80,00 % in der SR-Gruppe und 57,14 % in der S-Gruppe, verglichen mit dem in der Placebo-Gruppe einen Anteil von nur 25 %.Insbesondere erlitt keine der Mäuse in der Sx7R-Gruppe einen Gliedmaßenverlust.Wir präsentieren in Fig. 6c repräsentative Fotografien der Mäuse nach 0, 3, 7, 14 und 28 Tagen.Am Tag 3 war ein Unterschied in der Behandlungswirkung deutlich sichtbar.An Tag 28 wurde die Anzahl der Mikrogefäße in ischämischen Geweben unter Verwendung von IHC-Färbung (Abb. 6d) bewertet und quantifiziert (Abb. 6e).Sowohl in der SR- als auch in der Sx7R-Gruppe waren CD31+-Mikrogefäße reichlich vorhanden, denen CM aus lichtstimulierten Sphäroiden injiziert wurde, verglichen mit denen in den anderen Gruppen, während SM-α-Actin+-Mikrogefäße in den Sx7R-Gruppen im Vergleich zu den anderen Gruppen reichlich vorhanden waren.Laser-Doppler-Perfusionsbilder zeigten einen verbesserten Blutfluss in den Sx7R-Gruppen an Tag 3, 14, 21 und 28 im Vergleich zu dem in der S-Gruppe (ergänzende Abb. 2, ergänzende Anmerkung 1).Darüber hinaus zeigte das CM, das aus dicht inkubierten hADSC-Sphäroiden gewonnen wurde, die mit rotem Licht stimuliert wurden (Sx7R-Gruppe), eine signifikant verbesserte Geweberegeneration im Vergleich zu den anderen Gruppen, wie aus den H&E-Färbungsergebnissen hervorgeht (Abb. 6f).Die Expression von Hgf (Abb. 6g) und Pcna (Abb. 6h) in der ischämischen Extremität, die beide mit der Förderung von Regeneration und Proliferation zusammenhängen44,45, wurde mittels RT-qPCR quantifiziert.Die Expression von Hgf war in den S- und Sx7R-Gruppen im Vergleich zu der in der Placebo-Gruppe hochreguliert.Die Expression von Pcna war in der Sx7R-Gruppe im Vergleich zu der in der Placebo- und der S-Gruppe hochreguliert.Als nächstes analysierten wir die Expression von MyoD (Abb. 6i) und MyoG (Abb. 6j), die mit Muskelregeneration und Homöostase zusammenhängen46,47, in der ischämischen Extremität, die mit RT-qPCR quantifiziert wurde.Die SR-Gruppe hatte eine höhere MyoD-Expression als die S-Gruppe, und in der Sx7R-Gruppe wurde eine höhere Expression beobachtet als in der SR-Gruppe.Darüber hinaus zeigte die Sx7R-Gruppe im Vergleich zu den anderen Gruppen eine hochregulierte MyoG-Expression.Zusammenfassend stellte das CM aus der Sx7R-Gruppe, das eine sehr hohe Konzentration an proangiogenen parakrinen Faktoren aufwies, aufgrund der kontinuierlichen CM-Behandlung während der ersten 4 Tage die Blutgefäße schneller wieder her als das in den anderen Gruppen und somit die Tiere einen verminderten Muskelabbau erlebt.ein Zeitplan des In-vivo-Experiments.b Physiologischer Zustand der Ischämie der Hinterbeine 28 Tage nach den verschiedenen Behandlungen.c Repräsentative Fotos der Gliedmaßen in jeder Gruppe 0, 3, 7, 14 und 28 Tage nach verschiedenen Behandlungen.d IHC-Bilder von CD31- oder SM-α-Aktin-Expression (grüne Fluoreszenz) und DAPI-Färbung (blau) in den Hinterbeinregionen an Tag 28 (Maßstabsbalken = 100 μm: weiße Pfeile zeigen Gefäße an).e Relative Anzahl von CD31+- und SM-α+-Gefäßen in den Hinterbeinregionen an Tag 28 (n = 4, *p < 0,05 vs. Placebo-Gruppe, **p < 0,001 vs. Placebo-Gruppe, #p < 0,05 vs. jede Gruppe ).f Repräsentative Bilder der H&E-Färbung in den Hinterbeinregionen an Tag 28 (Maßstabsbalken = 250 μm: schwarze Pfeile zeigen Blutgefäße an).Relative Expression von g Hgh, h Pcna, i MyoD und j MyoG in den Hinterbeinregionen an Tag 28 (n = 3, *p < 0,05 vs. Placebo-Gruppe, #p < 0,05 vs. jede Gruppe).Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestelltIn dieser Studie verwendeten wir 3D-Kultur von hADSCs, Rotlichtbehandlung und dichte Zellkultur, um CM mit ausreichend hohen Konzentrationen an pro-angiogenen parakrinen Faktoren für die Behandlung von ischämischen Erkrankungen zu produzieren.Wie in den Ergebnissen detailliert beschrieben, war die angiogene Fähigkeit von hADSCs, die in 3D kultiviert wurden, im Vergleich zu der in der 2D-Kultur signifikant verbessert21,22.Um die Konzentration proangiogener parakriner Faktoren in CM zu erhöhen, wurden hADSCs in einer 3D-Sphäroidform kultiviert.Zusätzlich wurde rotes Licht verwendet, um die Sphäroide während der Kultur zu bestrahlen, um die CM-Produktion in einem serumfreien Medium zu induzieren (Abb. 2a).Je nach Bestrahlungsbedingungen induzieren mit Rotlicht behandelte Zellen über interzelluläre Veränderungen die Sekretion von angiogenen parakrinen Faktoren28,29,30.Das in dieser Studie zur Stimulation verwendete Rotlicht erhöhte die Sekretion von angiogenen parakrinen Faktoren aus den hADSC-Sphäroiden, ohne dass es zu strukturellen oder morphologischen Veränderungen des Sphäroids oder einer Abnahme der Zelllebensfähigkeit kam (Abb. 2–3).Insbesondere die Ergebnisse der IHC-Färbung bestätigten, dass HIF-1α- und VEGF-Proteine ​​innerhalb und außerhalb der Sphäroide in der SR-Gruppe gleichmäßig produziert wurden (Abb. 2e).Ein signifikanter Anstieg der HIF-1α-Expression wurde nicht beobachtet (Abb. 2b).Da die Expression von VEGF sowohl in der S- als auch in der SR-3D-Kulturgruppe im Vergleich zu der in der 2D-Gruppe signifikant zunahm ( 2b ), schlossen wir dennoch, dass der Spiegel des HIF-1α-Proteins stabil aufrechterhalten wurde.Darüber hinaus war die VEGF-Expression in der SR-Gruppe im Vergleich zu der in der S-Gruppe hochreguliert (Abb. 2b–d).Wir bestätigten eine Abnahme der VHL-Spiegel in der SR-Gruppe (Abb. 2d).Es ist bekannt, dass die VHL-Expression unter Hypoxie abnimmt48,49 und die SR-Gruppe zeigte nach der Behandlung eine Hochregulierung des intrazellulären ROS-Spiegels im Vergleich zur S-Gruppe (ergänzende Abb. 3a).Mit anderen Worten, im Gegensatz zur S-Gruppe, bei der nur die Zellen innerhalb des Sphäroids einer hypoxischen Umgebung ausgesetzt waren, zeigte die SR-Gruppe Unterschiede im Grad der VHL-Expression, da die äußeren Zellen des Sphäroids aufgrund der Lichteinwirkung ebenfalls einer leichten Hypoxie ausgesetzt waren .Die hypoxische Umgebung verstärkt die AKT-Aktivierung in Zellen50, aber wir haben keinen Unterschied in der AKT- (Abb. 2d) und Phospho-AKT-Expression (ergänzende Abb. 3b) zwischen den S- und SR-Gruppen beobachtet.Daher kann der verringerte VHL-Spiegel in der SR-Gruppe den Spiegel der angiogenen parakrinen Faktoren durch Erhöhung der HIF-1α-Stabilität erhöht haben.Darüber hinaus analysierten wir angiogene parakrine Faktoren im CM.Durch die Induktion interzellulärer Veränderungen in Sphäroiden mit rotem Licht bestätigten wir die erhöhte Konzentration und das Niveau verschiedener angiogener parakriner Faktoren im CM (Abb. 2e).Insbesondere die ELISA-Ergebnisse zeigten, dass die VEGF-Spiegel bei der gleichen Anzahl von hADSCs im Vergleich zu denen in der 2D-Gruppe um mehr als das 10-fache anstiegen (Abb. 2f).Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass die Expression von lichtempfindlichen Kanälen wie TRPV4 in der SR-Gruppe im Vergleich zu der in der S-Gruppe hochreguliert war (ergänzende Abb. 4a).Von TRPV4 ist bekannt, dass es die VEGF-Expression in Zellen verstärkt51,52,53.Darüber hinaus sezernierten dicht kultivierte hADSC-Sphäroidzellen mit gleichzeitiger Rotlichtstimulation eine erhöhte Menge an angiogenen parakrinen Faktoren im CM.Unter Verwendung von ELISA bestätigten wir die hohen Konzentrationen von VEGF und FGF2 im CM der Sx7R-Gruppe.Im Vergleich zur S-Gruppe stieg die Sekretion von VEGF und FGF2 im CM der Sx7R-Gruppe um etwa das 7-fache oder mehr an (Abb. 4g).Diese Ergebnisse wurden erreicht, indem einfach die Anzahl der Sphäroide erhöht wurde, die in der gleichen Fläche und im gleichen Volumen des Mediums kultiviert wurden, wenn eine Lichtbehandlung unter den gleichen Bedingungen wie bei der S-Gruppe durchgeführt wurde.Wenn wir die Konzentration der angiogenen parakrinen Faktoren durch spezielle Medikamente oder die Behandlung mit Nanopartikeln erhöhen, müssen wir auch die Anzahl derer erhöhen, die im Verhältnis zur Anzahl der Zellen eintreten.Da die Veränderung der Zellen jedoch durch Licht induziert wurde, war es in dieser Studie möglich, eine relativ hohe Konzentration zu erhalten, ohne die Behandlungsbedingungen zu ändern.Anschließend untersuchten wir die therapeutische Wirksamkeit der verschiedenen CMs.Unser hochkonzentriertes CM (aus der Sx7R-Gruppe) erhöhte effektiv die Lebensfähigkeit und Migrationsfähigkeit von hADSCs (Abb. 5a–d), und dies könnte auf die hohe VEGF-Konzentration in den CMs zurückzuführen sein.Darüber hinaus enthielt das in unserer Studie erzeugte CM eine Vielzahl von angiogenen parakrinen Faktoren in hohen Konzentrationen, wodurch die angiogene Fähigkeit von HUVECs effektiv verstärkt wurde (Abb. 5e, f).Darüber hinaus zeigte in der In-vivo-Studie (Abb. 6) das CM aus der Sx7R-Gruppe eine bessere therapeutische Wirkung;tatsächlich waren SM-α+-Mikrogefäße in der Sx7R-Gruppe reichlich vorhanden, und keine der Mäuse in dieser Behandlungsgruppe erlitt einen Gliedmaßenverlust.Die SR-Gruppe zeigte auch eine verbesserte Behandlungseffizienz im Vergleich zur S-Gruppe, wahrscheinlich weil das CM aus der SR-Gruppe aufgrund der Lichtstimulation Faktoren mit erhöhten Konzentrationen enthielt.Gemäß früheren Studien wird berichtet, dass die therapeutische Effizienz von ischämischen Erkrankungen zunimmt, wenn mehrere Faktoren zusammen injiziert werden, stärker als einzelne Faktoren wie VEGF oder HGF.Viele Forscher untersuchen die Kombination von Faktoren, die wirksam sind, wenn sie zusammen verabreicht werden, um die therapeutische Wirksamkeit zu verbessern.Darüber hinaus zeigte es bei der Injektion mehrerer Faktoren zusammen eine verstärkte therapeutische Wirkung sogar bei einer geringeren Faktorkonzentration als bei der Injektion einzelner Faktoren36,54,55.Daher erwarten wir, dass die Gesamtwirkung auf die Behandlung von ischämischen Erkrankungen bei Sx7R CM stärker sein könnte als bei einer VEGF-Einzelinjektion, selbst wenn die Konzentration von VEGF in Sx7R CM niedrig war.Bemerkenswerterweise verbesserte sich die Expression von muskelregenerationsbezogenen Genen in der ischämischen Extremität in der Sx7R-Gruppe (Abb. 6i, j).Die Sx7R-Gruppe, die eine sehr hohe Konzentration an pro-angiogenen parakrinen Faktoren aufwies, stellte die Blutgefäße schneller wieder her als andere Gruppen.Als Ergebnis zeigten die Modelltiere eine Verringerung der Muskeldegeneration.Da MyoD und MyoG myogene Regulatoren sind, die eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Muskeldifferenzierung spielen47,56, könnte die erhöhte Expression myogener Gene die Muskeldifferenzierung induzieren und das Muskelwachstum stimulieren, was möglicherweise zur Muskelhomöostase beitragen kann.Hier haben wir hADSC-Sphäroide entwickelt, die als Reaktion auf direkt angewandte LLLT-Techniken die Sekretion des angiogenen parakrinen Faktors förderten.Mit diesem Ansatz wollten wir die Einschränkungen der konventionellen CM überwinden und ihre Behandlungseffizienz steigern.Nach unserem besten Wissen gab es nur wenige Studien, die sich darauf konzentrierten, die LLLT-Technik zur Bestrahlung erkrankter Bereiche und Gewebe und nicht der Zellen selbst zu verwenden.Wenn die Tiefe des erkrankten Bereichs und Gewebes zunimmt, nimmt die Lichtdurchlässigkeit zum Gewebe schnell ab.Da Gewebe aus mehreren komplexen Molekülen besteht, ist es nicht ganz vernünftig, mit der aktuellen LLLT-Technik, bei der das Gewebe direkt bestrahlt wird, die gewünschte therapeutische Wirkung auf den erkrankten Bereich zu erwarten57.Die aktuelle LLLT-Technik verwendet einen Laser oder eine LED als Lichtquelle58;Im Gegensatz dazu haben wir OLEDs ausgewählt, weil sie weniger Wärme erzeugen als herkömmliche Lichtquellen und den Vorteil haben, in tragbaren Geräten eingesetzt zu werden59.In dieser Studie wurden hADSCs zu 3D-Sphäroiden kultiviert, um die Konzentration angiogener parakriner Faktoren im CM zu erhöhen, und es wurden günstige Ergebnisse erzielt.Wenn Zellen in 3D-Formen kultiviert werden, werden sie einer leicht hypoxischen Umgebung ausgesetzt, und die Sekretion von angiogenen parakrinen Faktoren nimmt entsprechend der Wechselwirkung zwischen der hypoxischen Umgebung und den Wachstumsfaktoren zu23,24,25.Obwohl die Expression von HIF-1α etwas andere Ergebnisse als erwartet zeigte, kann dies auf die kurze Dauer von HIF-1α60 zurückzuführen sein.Für eine genauere Analyse ist es notwendig, den Zeitpunkt zu optimieren, an dem sich die HIF-1α-Expression ändert61.Wenn HIF-1α unter Verwendung von HIF-1α-Inhibitor gehemmt wurde, war der VEGF-Spiegel im CM, das von S oder SR mit HIF-1α-Inhibitorgruppen stammte, im Vergleich zur S- oder SR-Gruppe deutlich verringert (ergänzende Fig. 4b).Darüber hinaus war die Genexpression von TRPV4 in der SR mit HIF-1α-Inhibitorgruppe im Vergleich zu den S mit oder ohne HIF-1α-Inhibitorgruppen deutlich erhöht (ergänzende Abb. 4c).Daher sind wir zu dem Schluss gekommen, dass die Hochregulierung der HIF-1α- und TRPV4-Expression durch Lichtbehandlung die angiogenen parakrinen Faktoren verstärkte.Da das in dieser Studie entwickelte CM mit hochkonzentrierten angiogenen parakrinen Faktoren keine exogenen Zellen oder chemischen Verbindungen enthält, ist zu erwarten, dass es nach Injektion und Transplantation in das Krankheitsgebiet keine nachteiligen Auswirkungen, wie z. B. eine Immunantwort, hat.Wir führten eine 3D-Kultur und Lichtbehandlung von hADSCs durch, um die Expression von angiogenen Faktoren im CM zu erhöhen.Wenn wir die Veränderungen der Faktorexpression durch hADSCs durch Modulation der Lichtbehandlungsbedingungen weiter untersuchen, könnte unsere Methode vermutlich für die Herstellung von CMs zur Behandlung anderer Krankheiten verwendet werden.Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.Ther.CAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarInt.Zellbiol.CAS PubMed-Artikel Google Scholaret al.Int.CAS PubMed-Artikel Google ScholarTher.Zelle.Mol.CAS PubMed-Artikel Google ScholarTher.Mol.biol.Auflösunget al.CAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarErw.Mater.CAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarAuflösungSemin.Chirurg.Vorderseite.Mol.CAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarAuflösungCAS PubMed-Artikel Google ScholarNat.CAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarVorderseite.biol.CAS PubMed-Artikel Google ScholarErw.Mater.Vorderseite.Bioeng.Biotechnologie.Bioeng.CAS PubMed-Artikel Google ScholarSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenBereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt