Wir verwenden Cookies, um Ihr Erlebnis zu verbessern.Indem Sie weiter auf dieser Website surfen, stimmen Sie unserer Verwendung von Cookies zu.Mehr Info.Ein kürzlich in der Zeitschrift STAR Protocols veröffentlichter Bericht beschreibt ein Protokoll für eine Antikörper-basierte Proximity-Markierung zur Entdeckung biotinylierter Interaktoren des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2).Studie: Ein Antikörper-basiertes Proximity-Labeling-Protokoll zur Identifizierung biotinylierter Interaktoren von SARS-CoV-2.Bildnachweis: Star ProtocolsDas Zusammenspiel zwischen Wirts- und SARS-CoV-2-Komponenten ist entscheidend für den viralen Lebenszyklus bei der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19).Die molekularen Mechanismen der viralen Pathogenität sind aufgrund der Komplexität der Virus-Wirt-Interaktion kaum verstanden.Das Verständnis viraler Proteinaktivitäten während einer Infektion erfordert die Darstellung des Virus-Wirt-Interaktoms.Ein Streptavidin-Anreicherungsansatz wurde kürzlich verwendet, um proximale Proteine ​​von SARS-CoV-2 auf der Grundlage von BioID zu untersuchen, einer Technik zur Identifizierung von Proteininteraktionen in lebenden Zellen.Dennoch waren die biotinylierten Peptide aufgrund der signifikanten Bindungsaffinität von Biotin und Streptavidin schwer zu lokalisieren, was für die Messung der Gewissheit von Näherungskontakten entscheidend war.In der vorliegenden Studie stellten die Autoren ein Protokoll zur Untersuchung von SARS-CoV-2-Protein-Interaktoren unter Verwendung der auf einem Antikörper basierenden TurboID-Proximity-Labeling-Technik bereit.TurboID ist eine Biotin-Ligase, die Biotin mithilfe von Adenosintriphosphat (ATP) in Biotin-Adenosin-Monophosphat (AMP) umwandelt.Die Wissenschaftler nutzten einen Biotin-spezifischen Antikörper, um proximale Proteine ​​von SARS-CoV-2 mit biotinylierten Peptiden zu verstärken, die mit TurboID-markierten Virusproteinen markiert waren.Das Team erläuterte die Verfahren zur Vorbereitung biotinylierter Peptidproben für die Massenspektrometrie (MS)-Analyse.Sie beschrieben auch einen strengen Arbeitsablauf zur Identifizierung biotinylierter hochzuverlässiger Interaktoren von SARS-CoV-2 durch das Screening unspezifischer co-gereinigter Proteine.Die Autoren konstruierten über sechs Wochen die Expressionsvektoren für SARS-CoV-2-Proteine.TurboID-Expressionsvektoren mit SARS-CoV-2-proteinkodierenden Sequenzen wurden verwendet, um mit TurboID markierte virale Proteine ​​zu erzeugen, und ihre Expression wurde verifiziert.Die Autoren gaben an, dass das Transfektionsreagenz durch Turbofect oder Lipofectamine 2000 ersetzt werden könnte.Die Annäherungsmarkierung durch TurboID-getaggte SARS-CoV-2-Proteine ​​wurde über eine Woche durchgeführt.TurboID-markierte SARS-CoV-2-Expressionsvektoren wurden in humane embryonale Nierenzellen 293T (HEK293T) transfiziert, um proximale Proteine ​​zu biotinylieren.Die Forscher betonten die Notwendigkeit äußerster Vorsicht beim Wechseln der Kulturmedien, um Zellverluste zu vermeiden, da sich HEK293T-Zellen leicht von den Platten trennen ließen.Die Pulszeit und die Leistungskapazität der Beschallung konnten bis zum Erreichen einer klaren Zelllyse eingestellt werden.Der Blockierungspuffer für Streptavidin-Meerrettichperoxidase (HRP) und Rinderserumalbumin (BSA) sollte frisch zubereitet werden.Der Proteinaufschluss durch filtergestützte Probenvorbereitung (FASP) wurde über zwei Tage durchgeführt.Zelllyseproteine ​​wurden alkyliert, minimiert und in Zentrifugalfiltereinheiten verdaut.Die Forscher beschafften und trockneten die verdauten Peptidkombinationen.Ebenso wurden auch Peptidverstärkung und Entsalzung in zwei Tagen durchgeführt.Verdaute Peptide wurden unter Verwendung des Anti-Biotin-Antikörpers vermehrt.StageTips wurden verwendet, um die extrahierten Peptide zu entsalzen, und Vakuumzentrifugation wurde verwendet, um sie zu trocknen.Schließlich führte das Team eine Woche lang eine MS- und Datenanalyse durch.Die Autoren erwähnten, dass die biotinylierten Peptide, die mit den von TurboID markierten SARS-CoV-2-Proteinen markiert waren, mit dem vorliegenden Ansatz direkt identifiziert wurden.Nach rigoroser Datenverarbeitung wurden diese signifikant verbesserten Proteine ​​mit biotinylierten Regionen in Probengruppen als hochgradig zuverlässige Interaktoren von SARS-CoV-2-Proteinen identifiziert.Die Generierung von TurboID-markierten SARS-CoV-2-Proteinen und ihre Fähigkeit, proximale Interaktoren zu markieren, ermöglicht eine gründliche Interaktom-Untersuchung von Wirtskomponenten und viralen Proteinen.Das vorliegende Protokoll verwendete einen Anti-Biotin-Antikörper, um proximale Proteine ​​zu erwerben, die biotinylierte Stellen beherbergen.Dies führte zur Erkennung von 1388 proximal interagierenden Molekülen von SARS-CoV-2-Proteinen mit hoher Zuverlässigkeit, von denen 1092 nicht durch die Streptavidin-basierte BioID-Analyse in der SARS-CoV-2-Interaktomforschung untersucht wurden.Somit werden die Vorteile der Antikörper-basierten TurboID-Technik bei der Lokalisierung proximaler Interaktoren demonstriert.Die resultierenden Daten werden bei der Entdeckung der SARS-CoV-2-Pathogenese und der Entwicklung der COVID-19-Therapie helfen.Die Autoren schlugen Lösungen für einige der Probleme vor, die während der Analysen aufgetreten sind:1. Schlechtes Transfektionspotential von TurboID-Fusionsexpressionsvektoren.Mögliche Lösung: Das bei -20 °C gehaltene aliquotierte Polyetherimid (PEI) sollte bei Raumtemperatur (RT) vollständig gelöst werden.Unlösliche Partikel können fast eine halbe Stunde lang auf 65°C erhitzt werden, bis die Lösung klar wird.Minimieren Sie außerdem die Gefrier-Tau-Zyklen von PEI.2. Western Blots identifizierten die Expression von TurboID-markierten SARS-CoV-2-Proteinen nicht.Mögliche Lösung: Die Substitution des Cytomegalovirus (CMV)-Promotors durch den CMV-Enhancer, den Hühner-β-Aktin-Promotor und die Kaninchen-β-Globin-Spleißakzeptorstelle (CAG) des Vektors verstärkt ihre Expression.Verbessern Sie für den eukaryotischen Expressionsvektor die komplementären Desoxyribonukleinsäure (cDNA)-Codons des viralen offenen Leserahmens (ORF).Zusätzlich sollten virale Proteine ​​und TurboID alternativ orientiert werden.3. Niedrige Expression von biotinylierten Proteinen, identifiziert durch Western Blot.Mögliche Lösung: Ernten Sie die Zellen 48 Stunden nach der Transfektion für virale Proteine ​​mit hohem Molekulargewicht, was zur Biotinylierung und zum Nachweis von proximalen Proteinen führt.4. Ceratin-biotinylierte Proteine ​​waren drastisch schwach, um durch Western Blot unter Verwendung von Streptavidin-HRP nachgewiesen zu werden.Mögliche Lösung: Bestimmte virale Proteine ​​mit TurboID-Tag besitzen schwächere Biotinylierungssignale und interagieren mit weniger proximalen Proteinen als andere.Stapeln Sie TurboID immer ohne und mit Biotinkontrollen, die Proben enthalten, auf derselben Membran, um die Probenbiotinylierung zu validieren.5. Biotinylierte Proteine ​​wurden effektiv erkannt, obwohl Flüssigchromatographie mit Tandem-MS (LC-MS-MS) nur weniger Proteine ​​identifizierte.Mögliche Lösung: Dies könnte auf einen Proteinverlust beim Bead-Waschprozess zurückzuführen sein.Pipettieren Sie nicht viel auf und ab, um zu vermeiden, dass Kügelchen an den Pipettenspitzen haften bleiben.Aspirieren Sie den Überstand vorsichtig ohne Kügelchen.Veröffentlicht in: Molekular- und Strukturbiologie |Nachrichten aus der Medizinwissenschaft |Neuigkeiten zu Krankheiten/InfektionenTags: Aktin, Adenosin, Adenosintriphosphat, Albumin, Antikörper, Bindungsaffinität, Rinderserumalbumin, Zelle, Zelllyse, Chromatographie, Coronavirus, Coronavirus-Krankheit COVID-19, covid-19, Cytomegalovirus, Verdauung, Interaktom, Niere, Ligase, Flüssigkeit Chromatographie, Massenspektrometrie, Membran, Peptide, Promotor, Protein, Forschung, Atemwegserkrankungen, Probenvorbereitung, SARS, SARS-CoV-2, schwere akute Atemwegserkrankung, schweres akutes Atemwegssyndrom, Spektrometrie, Syndrom, Transfektion, Virus, Western BlotShanet Susan Alex, eine medizinische Autorin aus Kerala, Indien, hat einen Doktortitel in Pharmazie von der Kerala University of Health Sciences.Ihr akademischer Hintergrund liegt in der klinischen Pharmazie und Forschung, und sie hat eine Leidenschaft für medizinisches Schreiben.Shanet hat Artikel im International Journal of Medical Science and Current Research (IJMSCR), im International Journal of Pharmacy (IJP) und im International Journal of Medical Science and Applied Research (IJMSAR) veröffentlicht.Neben der Arbeit hört sie gerne Musik und schaut Filme.Bitte verwenden Sie eines der folgenden Formate, um diesen Artikel in Ihrem Essay, Ihrer Arbeit oder Ihrem Bericht zu zitieren:Susan Alex, Shanet.(2022, 03. Mai).Näherungskennzeichnung zur Identifizierung von hochgradig zuverlässigen SARS-CoV-2-Interaktoren.News-Medical.Abgerufen am 05. Mai 2022 von https://www.news-medical.net/news/20220503/Proximity-labeling-to-identify-high-confidence-SARS-CoV-2-interactors.aspx.Susan Alex, Shanet."Näherungskennzeichnung zur Identifizierung von SARS-CoV-2-Interaktoren mit hohem Vertrauen".News-Medical.05. Mai 2022.